HPLC
QualitätHigh Performance Liquid Chromatography. Analysemethode zur Bestimmung der Reinheit und Zusammensetzung von Peptiden. Goldstandard für COA-Zertifikate.
Ausführlich erklärt
Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wird eine gelöste Probe unter hohem Druck durch eine dünne Säule gepumpt, die mit feinen Partikeln gefüllt ist. Für Peptide nutzt man meist die Umkehrphasen-Chromatographie: Die Partikel sind wasserabweisend beschichtet, und Moleküle werden umso länger zurückgehalten, je hydrophober sie sind. Ein Detektor, oft ein UV-Detektor, registriert die Substanzen beim Austritt aus der Säule als Peaks in einem Chromatogramm.
Die Reinheit wird als Flächenanteil des Hauptpeaks an der Gesamtfläche angegeben. Ein Beispiel: Bei der Festphasensynthese entstehen Nebenprodukte, denen eine Aminosäure fehlt. Solche Fehlsequenzen erscheinen oft als kleine Peaks nahe am Hauptsignal und lassen sich so erkennen, sofern sie sich chromatographisch trennen.
Bedeutung in der Peptidforschung
HPLC ist in der Peptidchemie allgegenwärtig: zur Reinigung nach der Synthese, zur Qualitätskontrolle und zur Stabilitätsprüfung, bei der man verfolgt, ob über die Zeit Abbauprodukte entstehen. Die Methode ist Bestandteil nahezu jedes Analysezertifikats für synthetische Peptide und wird in pharmazeutischen Arzneibüchern für viele Peptidwirkstoffe vorgeschrieben.
Einordnung
HPLC allein beweist nicht die Identität eines Peptids, denn ein falsches Molekül kann ebenso einen sauberen Einzelpeak liefern. Dafür ist die Kopplung mit der Massenspektrometrie nötig. Salze, Wasser und Gegenionen erfasst die UV-basierte Reinheitsangabe in der Regel nicht.